Ultrafiltrazione a fibra cava da 300 kd: analisi di un processo di concentrazione e purificazione ad alta-efficienza per il virus O/A dell'afta epizootica-e-della bocca

Introduzione

L'afta-e{1}}bocca (FMD) è una malattia animale acuta, febbrile e altamente contagiosa causata dal virus dell'afta epizootica (FMDV). Questo virus colpisce gli animali fessi-ungulati, con oltre 70 specie sensibili. Si diffonde rapidamente e presenta un elevato tasso di morbilità, interessando in genere i principali animali da reddito come suini, ovini e bovini, dove l'incidenza può raggiungere il 100%. L'afta epizootica appartiene al genereVirus del piede-e-della boccadella famiglia MicroRNAviridae. Le particelle sono sferiche, di circa 27-30 nm di diametro, con un coefficiente di sedimentazione di 146S per le particelle virali intatte. Attualmente sono disponibili vari vaccini contro l’afta epizootica, inclusi vaccini con virus vivi attenuati, vaccini con vettori di virus vivi, vaccini inattivati, vaccini con acido nucleico, vaccini peptidici sintetici e vaccini a subunità. I vaccini inattivati ​​contro l’afta epizootica generalmente hanno meno effetti collaterali negli animali, mentre i vaccini multivalenti offrono una migliore efficacia immunitaria, rendendoli il pilastro della prevenzione dell’afta epizootica in Cina.

Ultrafiltrazione a flusso tangenziale

Attualmente, l'ultrafiltrazione a flusso tangenziale è un metodo di purificazione e concentrazione comunemente utilizzato nella produzione su larga scala-di vaccini inattivati ​​multivalenti-e-per l'afta epizootica. Questo metodo non solo raggiunge il fattore di concentrazione desiderato ma rimuove anche una grande quantità di impurità estranee. L'ultrafiltrazione a flusso tangenziale viene utilizzata principalmente per la purificazione, la concentrazione e la filtrazione (dissalazione e sostituzione del tampone). Inoltre, può essere utilizzato anche per la chiarificazione del brodo di fermentazione o del terreno di coltura cellulare mediante microfiltrazione a flusso tangenziale, sostituendo così la centrifugazione o la chiarificazione primaria.

Nella filtrazione verticale convenzionale, le grandi molecole tendono ad aggregarsi sulla superficie della membrana, intasando il filtro. La filtrazione a flusso tangenziale, invece, permette al flusso di procedere parallelamente alla membrana, evitando questo problema di intasamento. Durante la filtrazione a flusso tangenziale, il solvente e le sostanze più piccole della dimensione dei pori della membrana che permeano attraverso la membrana sono chiamati permeato, mentre le sostanze più grandi della dimensione dei pori vengono trattenute come concentrato. In combinazione con processi di lavaggio e filtrazione ottimizzati, è possibile ottenere la separazione e la purificazione di molecole di varie dimensioni. Questa tecnologia offre vantaggi quali basso costo, condizioni operative blande, pulizia e sostituzione comode, portata elevata del permeato della membrana e funzionamento semplice, rendendola particolarmente adatta per la concentrazione e la purificazione su larga scala-di sostanze bioattive.

Materiali e metodi

Risultati e discussione

In termini di purificazione iniziale del virus, la concentrazione di ultrafiltrazione raggiunge un tasso di rimozione superiore al 90% per le impurità come le proteine ​​che non contengono virus. In termini di volume, può raggiungere concentrazioni elevate pari a 10-50 volte, fornendo un forte supporto per la successiva purificazione. Viene selezionata una colonna a fibra cava con un limite di peso molecolare di 300 kd. Questa dimensione dei pori, pur trattenendo oltre l’85% del virus, può rimuovere oltre il 90% delle proteine ​​impure. L'area della membrana è di 1600 cm² e la produttività è di 2-5 ml/cm², consentendo di completare la concentrazione dell'ultrafiltrazione entro un tempo effettivo (entro 2 ore). I dati dettagliati sulla concentrazione di ultrafiltrazione e sulla purificazione sono mostrati nella Tabella 1.

Tabella 1. Risultati del rilevamento totale degli antigeni dell'afta epizootica (tipi O e A)

Considerazioni sul metodo di purificazione

Attualmente esistono vari metodi di purificazione, ma anche con lo stesso metodo per lo stesso antigene, l'effetto di purificazione è spesso insoddisfacente per molte ragioni, tra cui la caratterizzazione dell'antigene e i parametri di processo. Ad esempio, i cambiamenti nella progettazione molecolare a monte o nei sistemi di coltura della fermentazione possono alterare la struttura molecolare virale, portando a risultati di purificazione insoddisfacenti. Metodi di chiarificazione inappropriati possono aumentare i costi delle materie prime o la quantità di proteine ​​eterologhe, aumentando la pressione sulla purificazione a valle. Una concentrazione di ultrafiltrazione inadeguata, come diverse dimensioni dei pori della membrana di ultrafiltrazione, fattori di concentrazione ed eluizione, velocità di flusso in ingresso, velocità di filtrazione e TMP, possono comportare bassi tassi di recupero dell'antigene. La pratica approfondita dimostra che una scarsa purificazione può causare reazioni avverse significative negli animali dopo l’immunizzazione, portando potenzialmente alla morte.