Studio di ottimizzazione del processo di purificazione a valle del liquido raccolto di embrioni di pollo per il virus dell'influenza di tipo IV (Parte 1)

L'influenza (nota anche come influenza) è una malattia infettiva respiratoria altamente contagiosa che può causare una varietà di malattie respiratorie. Secondo dati autorevoli dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), ogni anno circa un miliardo di persone sono minacciate dai virus dell’influenza. I virus dell'influenza (IV) appartengono alla famiglia Orthomyxoviridae e sono virus a RNA a-senso negativo a singolo filamento. Le particelle del virus dell'influenza sono sferiche, con un diametro di 80-120 nm, e la loro struttura può essere divisa dall'esterno in tre strati: un involucro, proteine ​​della matrice e un nucleo.

 

Struttura dei virus dell'influenza A e B

I farmaci antivirali e la vaccinazione diretta contro l’influenza sono passi cruciali nell’attuale trattamento e prevenzione dell’influenza. Attualmente, la matrice di embrioni di pollo e la matrice cellulare sono metodi comunemente usati nella ricerca sui vaccini antinfluenzali, e gli embrioni di pollo sono la scelta scelta più frequentemente per preparare il fluido del virus dell'influenza da parte dei ricercatori sia a livello nazionale che internazionale. Il fluido del virus allantoico dell'embrione di pollo contiene numerose impurità, come l'ovoalbumina e le proteine ​​strutturali virali. L'ovalbumina è un componente significativo che può causare reazioni allergiche negli individui immunizzati con vaccino-. Pertanto, la chiarificazione, la concentrazione e la purificazione del fluido del virus allantoico dell'embrione di pollo sono passaggi essenziali nello sviluppo dei vaccini contro il virus dell'influenza.

Attualmente, la tecnologia di chiarificazione dei fluidi per la raccolta dei virus comunemente utilizzata è la centrifugazione + filtrazione profonda. I metodi principali per purificare il virus dell’influenza comprendono l’ultrafiltrazione, l’ultracentrifugazione, la cromatografia con filtrazione su gel e la cromatografia combinata.

Questo studio mira a studiare le caratteristiche dell'infezione di quattro virus influenzali-H1N1, H3N2, BV e BY-in embrioni di pollo di 9-11 giorni. Il fluido allantoico virale monovalente è stato ottenuto attraverso la coltura di embrioni di pollo per fornire un materiale di base per la successiva elaborazione virale a valle. Durante lo studio sono stati confrontati diversi metodi di chiarificazione, concentrazione e purificazione per ottimizzare la separazione della proteina bersaglio da altri componenti (come proteine ​​varie e ovoalbumina).

Roadmap tecnologica sperimentale

Gli embrioni di pollo sono stati coltivati ​​a 37 gradi per 9-11 giorni. Sono stati quindi inoculati con il virus dell'influenza A (A1 per H1N1, A3 per H3N2) con un MOI di 1:10.000 e il virus dell'influenza B (B1 per BV, B2 per BY) con un MOI di 1:10.000. I virus H1N1 e H3N2 sono stati coltivati ​​a 33-34 gradi per 48 ore, mentre i virus BV e BY sono stati coltivati ​​a 33 gradi per 7,2 ore. Gli embrioni sono stati poi raffreddati ed è stato raccolto il liquido allantoico. Il fluido allantoico aveva un elevato contenuto proteico totale, un'elevata viscosità e appariva torbido, rendendo difficile la chiarificazione.

Effetti di diversi processi di chiarificazione sulla qualità del fluido di raccolta del virus dell'influenza di tipo IV

La chiarificazione è una fase essenziale nel processo di purificazione, poiché funge da pretrattamento preliminare per un gran numero di impurità insolubili. Questo passaggio utilizza il fluido allantoico come materia prima. Dopo la centrifugazione a flusso continuo ad alta velocità-, il fluido viene chiarificato e filtrato attraverso cartucce filtranti con dimensioni dei pori di 3μm e 0.8+0.45μm e 3μm e 0.8+0.65μm. Vengono studiati gli effetti delle due dimensioni della cartuccia filtrante sul processo di chiarificazione e sui risultati e viene selezionato uno schema di chiarificazione adeguato per determinare il processo di chiarificazione ottimale.

I risultati dei quattro tipi di test del fluido di chiarificazione del virus dell'influenza sono mostrati nelle Figure 1-3 . CA1-1 rappresenta i risultati del fluido di chiarificazione testato utilizzando cartucce filtranti da 3μm e 0.8+0.65μm, CA1-2 rappresenta i risultati del fluido di chiarificazione testato utilizzando cartucce filtranti da 3μm e 0.8+0.45μm e il resto è simile.

Figura 1. Risultati del rilevamento della soluzione chiarificata del virus dell'influenza - contenuto proteico totale

Figura 2. Risultati del rilevamento del titolo di emoagglutinazione della soluzione chiarificata del virus dell'influenza -

Figura 3. Risultati del rilevamento della soluzione chiarificata del virus dell'influenza - tasso di rimozione proteica totale

I risultati hanno mostrato che, nonostante vi fossero differenze numeriche nel contenuto proteico totale e nel tasso di rimozione totale delle proteine ​​tra i gruppi, non vi erano differenze significative. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che le dimensioni dei pori delle cartucce filtranti erano troppo piccole e tutte potevano soddisfare i requisiti di chiarificazione. Per quanto riguarda il titolo di coagulazione del sangue, le cartucce filtranti da 3μm e 0.8+0.45μm hanno mostrato titoli di coagulazione del sangue più elevati. Pertanto, per una chiarificazione ottimale, sono state selezionate le dimensioni dei pori più piccole delle cartucce filtranti da 3μm e 0.8+0.45μm.

Riferimenti: Huang, Zhentian. Ottimizzazione del processo di produzione a valle del vaccino quadrivalente split contro il virus dell’influenza [D]. Università agricola di Shenyang, 2024. DOI:10.27327/d.cnki.gshnu.2024.001595.