Filtrazione a flusso tangenziale TFF combinata con l'ultracentrifugazione per un'efficiente preparazione di piccole vescicole extracellulari

Piccole vescicole extracellulari (sEV) sono vescicole su scala nanometrica secrete da cellule che contengono acidi nucleici, proteine, piccole molecole e altri componenti e svolgono un ruolo importante nella comunicazione intercellulare. Le piccole vescicole extracellulari di tipo esosoma- condividono elevate somiglianze con le cellule madri. Rispetto alle nanoparticelle artificiali, mostrano tassi di eliminazione immunitaria più bassi e una minore citotossicità, rendendole promettenti candidati come nuoviveicoli per la somministrazione di farmaci in vivo. Quasi tutti i tipi di cellule possono secernere queste vescicole e la ricerca sulla loro applicazione come trasportatori di farmaci si sta gradualmente spostando dal laboratorio verso le applicazioni cliniche. Tuttavia,la produzione su-scala continua a rappresentare un grave collo di bottiglia.

 

Metodi attuali per l'isolamento delle vescicole extracellulari

Gli attuali metodi di isolamento delle vescicole extracellulari includonoultracentrifugazione, centrifugazione in gradiente di densità, cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) e precipitazione di glicole polietilenico (PEG).

La precipitazione del PEG offre un rendimento elevato e un funzionamento semplice, ma è associata a una significativa contaminazione da parte di proteine ​​indesiderate. La centrifugazione in gradiente di densità e la cromatografia ad esclusione dimensionale possono fornire prodotti di elevata purezza, ma la loro efficienza è relativamente bassa e i processi richiedono molto tempo. L’ultracentrifugazione è ampiamente utilizzata, ma il suo volume di lavorazione è limitato dalla capacità della centrifuga, rendendone difficile l’espansione.

 

Applicazione della filtrazione del flusso tangenziale per la separazione sEV

La filtrazione a flusso tangenziale (TFF) è già stata applicata alla separazione di nanoparticelle come liposomi e vettori lentivirali. Nel TFF, l'alimentazione scorre tangenzialmente attraverso la superficie della membrana, il che aiuta a ridurre l'incrostazione della membrana e facilita l'espansione del processo.

Poiché le piccole vescicole extracellulari generalmente vanno da30–200 nmdi diametro, aCassetta con membrana da 0,45 μmpuò essere selezionato nel sistema TFF per rimuovere proteine ​​e vescicole più grandi, mentre aCassetta a membrana da 300 kDapuò essere utilizzato per rimuovere proteine ​​di piccolo-peso molecolare e concentrare le piccole vescicole extracellulari presenti nel terreno di coltura.

 

Caratterizzazione della materia prima dopo la separazione del TFF

L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) ha mostrato che i diametri delle particelle erano distribuiti principalmente nell'intervallo0–250 nm.

 

 

Tuttavia, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha rivelato una grande quantità di proteine ​​contaminanti, mentre non sono state osservate vescicole extracellulari. Questi risultati hanno indicato che era necessaria un'ulteriore fase di purificazione a valle per purificare ulteriormente le vescicole extracellulari.

 

Caratterizzazione del concentrato TFF dopo ultrafiltrazione da 100 kDa

Il concentrato di TFF è stato ulteriormente elaborato utilizzando aTubo per ultrafiltrazione da 100 kDa.

L'NTA ha dimostrato che i diametri delle particelle nei concentrati ottenuti dopo uno e due cicli di ultrafiltrazione rimanevano principalmente entro l'intervallo di0–250 nm. Tuttavia, l'esecuzione dell'ultrafiltrazione due volte ha comportato una riduzione significativa del numero di particelle ottenute.

L'analisi TEM ha mostrato che non è stata osservata alcuna struttura simile a vescicole nei concentrati di ultrafiltrazione una-o due-volte, mentre è rimasta una notevole quantità di proteine ​​contaminanti.

Perciò,L'ultrafiltrazione da 100 kDa non può essere utilizzata efficacemente per purificare il terreno di coltura dopo la concentrazione di TFF.

 

 

Caratterizzazione del concentrato TFF purificato mediante ultracentrifugazione

L'NTA ha dimostrato che i diametri delle particelle dei prodotti purificati erano distribuiti principalmente nell'intervallo di0–250 nm.

È importante sottolineare che la TEM ha rivelato chiaramente strutture simili a vescicole-in diversi campi visivi. Questi risultati hanno dimostrato che dopo aver concentrato il terreno di coltura utilizzando TFF,l'ultracentrifugazione può essere successivamente impiegata per un'ulteriore separazione e purificazione delle vescicole extracellulari.

 

 

Caratterizzazione di sEV isolati da terreno condizionato con cellule staminali mesenchimali utilizzando TFF combinato con ultracentrifugazione

L'NTA ha dimostrato che i diametri delle particelle dei prodotti purificati erano distribuiti principalmente nell'intervallo di0–250 nm.

Strutture simili a vescicole- sono state osservate dal TEM. L'analisi Western blot ha dimostrato un'espressione positiva delle proteine ​​associate alle vescicole extracellulari-CD9, CD63 e ALIXnelle vescicole extracellulari purificate.

Questi risultati hanno confermato che le piccole vescicole extracellulari purificate contenevano esosomi, indicando che questo metodo può essere utilizzato anche per questoisolamento ed estrazione degli esosomi.

 

 

Conclusione: TFF combinato con l'ultracentrifugazione per la preparazione di sEV di alta-qualità

Lo studio lo ha dimostratoSolo concentrazione di TFFha prodotto un prodotto contenente una notevole quantità di proteine ​​contaminanti e quindi insufficiente per ottenere vescicole extracellulari qualificate.

Allo stesso modo, utilizzando aTubo di ultrafiltrazione da 100 kDa per purificazione secondarianon ha effettivamente prodotto strutture vescicolari intatte.

Combinando la concentrazione di TFF con la successiva purificazione tramite ultracentrifugazione, è possibile integrare i vantaggi di entrambe le tecniche per ottenereprodotti di piccole vescicole extracellulari di alta-qualità.

Rispetto alla sola ultracentrifugazione convenzionale, il processo combinato può essere efficaceridurre il tempo di elaborazione complessivo e migliorare l'efficienza della separazione.

In questo flusso di lavoro,TFF consente un rapido arricchimento di campioni di-volumi di grandi dimensioni, affrontando la limitazione dell'ultracentrifugazione convenzionale nel trattamento di grandi volumi di campioni. L'ultracentrifugazione esegue quindi una purificazione profonda per rimuovere le impurità proteiche co-concentrate, contribuendo al tempo stesso a mantenere la purezza e l'integrità delle vescicole.

Inoltre, il processo non richiede l'aggiunta direagenti chimici esogeni di precipitazione, contribuendo a preservare nella massima misura possibile l'attività biologica delle vescicole.

Dal punto di vista della traduzione industriale, questo processo ha un significato significativopotenziale di-aumentoe potrebbe contribuire ad affrontare le sfide associate alla-produzione su larga scala di vescicole extracellularisomministrazione di farmaci, medicina rigenerativa e sviluppo di prodotti correlati. Fornisce inoltre una solida base sperimentale per la successiva ottimizzazione dei processi e la produzione su scala pilota-.

 

Riferimento

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha et al.Creazione di un metodo per la separazione di piccole vescicole extracellulari mediante filtrazione a flusso tangenziale combinata con ultracentrifugazione. Giornale cinese di prodotti biologici, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.